“这种探针很细 ， 对细胞的损伤很小 ， 就像‘鱼钩’一样 ， 改造后可以把细胞中的RNA‘钓’出来 ， 又能保证细胞继续存活 。我们改造了数十个探针后 ， 结果只在两个细胞上成功“钓”到了基因 。”陈万泽回忆道 ， 当时购买一个原子力显微镜探针需要800美元 ， 研究成本太高 ， 成功率太低 ， 让这项研究再次面临阻碍 。
瑞士洛桑联邦理工学院学科交叉氛围浓厚 ， 在一次偶然的学术交流中 ， 陈万泽与导师了解到 ， 瑞士苏黎世联邦理工学院的Julia Vorholt实验室开发了一种特殊的原子力显微镜 ， 能够吸出一部分的细胞质 。
一番交流后 ， 两个课题组一拍即合 ， 展开了联合攻关 。联合团队对一系列的实验过程进行了优化 ， 包括解决了RNA降解、低温下的快速操作、超微量样品转移、采样通道清洗避免交叉污染、图像下追踪细胞等多种问题 ， 以保证实验结果的可靠性 。
联合团队利用重新改造后的Live-seq ， 对五种类型共295个细胞进行了测序 ， 发现Live-seq能够有效区分不同类型的细胞 ， 且平均每个细胞能检测到约4112个基因的表达信息 。
仅对少量的细胞质进行测序 ， 是否就能代表细胞的状态？
“我们平行比较了单细胞测序结果 ， 发现活细胞测序结果与普通的单细胞测序结果高度吻合 ， 证明Live-seq能够很好地体现细胞的全转录组状态 。”陈万泽说道 。
细胞的存活率又如何保证呢？
“原子力探针尖端只有几百个纳米大小 ， 而且能和细胞膜密封 ， 对细胞损伤极小 。吸取约5%至50%的细胞质后 ， 细胞体积可以快速恢复到正常水平 ， 存活率在85%至89%之间 ， 细胞能进行正常分裂 。通过一系列的功能分析和分子表征 ， 我们没有发现Live-seq对细胞的状态有显著的影响 。”陈万泽表示 。
对此 ， 审稿人在评审意见中也写道：“由于细胞测序后仍旧存活 ， Live-seq首次实现对同一个细胞全基因表达的连续测量 。”
细胞测序史从“高清图片”到“高清电影”的跨越
在细胞观测技术史上 ， 显微成像和基因编辑介导的分子记录等技术不仅能观察细胞水平的生长、分裂、死亡等过程 ， 还能观测细胞中的单个或几个基因指标 。
2009年 ， 单细胞转录组测序技术为更系统全面地定义细胞类型和状态提供了变革性手段 。但人们仍然只能观察到细胞的静态状态 ， 无法连续观测细胞的动态或者检查细胞后续的表型 。
如果将利用单细胞转录组测序技术观测细胞比喻为看一张细胞在分子水平的高清图片 ， 那么利用Live-seq观测细胞 ， 就好比看一部高清电影 ， 能够看见细胞的“前世今生” 。
“Live-seq可以回答细胞怎样的过去决定了它的现在 ， 不只知道细胞中为何存在差异 ， 还知道这些差异从何而来 。”陈万泽介绍道 。
在验证实验中 ， 研究团队利用Live-seq直接测定了同一个巨噬细胞在不同时间的状态变化 ， 发现细胞起始状态的少数基因的表达差异和噪音（如Nfkbia、Gsn等）是决定细胞后续反应差异的重要原因 。对应地 ， 普通的单细胞转录组无法找到这些规律 。
【科学家开发“微创”提取技术 让活细胞测序成为可能】陈万泽表示 ， 尽管Live-seq仍然存在诸多挑战 ， 需要进一步完善 ， 比如低通量、暂不能在体内应用、在高度极化且mRNA分布不均的细胞中无法实现全细胞转录组测序、对细胞更多次的采样还需进一步研究等 ， 但该技术首次实现了活细胞连续观测 ， 也为单细胞测序技术发展带来了更多可能性 。未来 ， 团队将进一步进行深入研究 ， 提高Live-seq技术的可用性 。