基因测序3——三、四代测序来势汹汹，国产化仍在布局二代测序？( 二 ) 导读【行业分析】基因测序系

当DNA合成进行时，连接上的dNTP由于在ZMW底部停留的时间较长 (约200ms) ，其荧光信号能够与本底噪音区分开来，从而被识别。荧光基团被连接在dNTP的磷酸基团上，因此在延伸下一个碱基时，上一个dNTP的荧光基团被切除，从而保证了检测的连续性，提高了检测速度。SMRT的测序原理[2]如图所示。
与tSMS类似，因为单分子的荧光信号较弱， SMRT的单碱基准确率仅有87.5% ，但由于错误是随机产生的，通过多重测序和校正，在10×的条件下，准确率可提高到99.9% 。
2、相关厂家及仪器
到目前为止， PacBio公司基于SMRT测序技术共推出了三款测序仪，第一款产品PacBio RS在2011年正式发布并商用；2013年4月发布了升级版PacBio RS Ⅱ；SMRT的一大优势是超长的读长， PacBio RS II测序平台能够得到的最大读长为30Kb ，平均读长约8.5Kb ，是目前所有商品化测序仪中读长最长的。一个SMRT cell单次运行产生的数据量约为400Mb ，一天能够产生最多6.4Gb的数据。
2015年2015年10月推出全新升级的三代测序仪PacBio Sequel测序系统。Sequel系统变得更加灵巧，身体体积和重量仅为原来的1/3 ，相对于Illumina Hiseq的体积也缩小11% ，但是增大了SMRT Cell运作空间，大大提高了数据产出，减少测序成本。测序读长：平均测序读长达到10 ~ 18 kb ，最长可超过60 kb；

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PacBio公司仪器（左. Sequel；右. RS II）[3]
据称，在2019年中国已成为PacBio第三代单分子测序仪装机量仅次于美国的国家，达到了120台。其中2017年，诺禾致源（Novogene）采购了10台Sequel系统用于全基因组测序、Iso-Seq以及靶向测序服务。中国测序服务供应商希望组（GrandOmics）于向PacBio采购了五台Sequel测序仪。2018年，深圳华大基因（BGI）BGI在拥有2台Sequel系统和一台PacBio RS II测序仪的基础上再次订购了10台Sequel测序仪。2018年底，中国科学院上海生命科学研究院2台Sequel测序仪，单台价格人民币3674500元。
【基因测序3——三、四代测序来势汹汹，国产化仍在布局二代测序？】纳米孔测序技术
1、测序原理
纳米孔测序技术（又称第四代测序技术）是最近几年兴起的新一代测序技术，不需要对?DNA?进行生物或化学处理，而是基于物理的原理进行测序，其简要原理是将经过提取的DNA的其实一条单链一端与一种特殊的蛋白连接并可控制序列进入速度的作用。每个纳米孔会结合一个核酸外切酶，孔内共价结合有分子接头。单链DNA或RNA分子通过纳米级的小孔时，由于碱基形状大小不同，引起孔内电阻变化，通过测到这些特征电流，就能够识别出通过小孔的DNA分子上的碱基排列。同时因为DNA两条单链相互连接，这样DNA的正义链和反义链可以依次通过纳米孔测序，它们组合成2D read ，并可相互印证。测序原理见下图。
纳米孔测序技术原理[4]
2、相关仪器
目前Oxford Nanopore公司推出的基于纳米孔测序技术的测序平台包括MinION、GridION和PromethION 。（如下图）
Oxford Nanopore公司测序平台（来自Oxford Nanopore公司官网，和义广业整理）
MinION系列测序仪主打便携、即刻，仪器单重仅为450克，尺寸比手机大不了多少，可以在样品来源处进行测序。立即数据流式传输，可快速获得可操作的结果。仅可适用单个流通池，但单个流动池中50 Gb的数据50 Gb的数据生成短至超长（> 4 Mb）读数，以提供最终的实验灵活性。官网称可适用于整个基因组/外显子组、元基因组学、靶向测序、全转录组（cDNA）、较小的转录组（直接RNA）以及多路复用以获取较小的样本。