科研 | 中科院成都生物所：甲烷氧化与硝化-反硝化耦合的微生物群落结构和功能的划分（国人佳作）( 五 ) 作者：微生态编译：微科盟H

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图6 （a）甲烷氧化菌与pmoA基因拷贝数、（b）AOB与AOB-amoA基因拷贝数、（c）NOB与nxrB基因拷贝数、（d）反硝化菌与nirS基因拷贝数的相对丰度的线性回归。y坐标中的数字表示功能基因的拷贝数。x坐标中的数字表明功能微生物的相对丰度（%）。
氨氧化细菌中与氨氧化相关的AOB-amoA基因丰度范围为109-1011copies/g样本，并且随着中空膜和液体中O2/CH4比的增加而略有增加（图5d-f）。在混合填料中观察到AOB-amoA基因丰富有明显的上升趋势，从2.95×109到1.71×1011 copies/g 样本。液体/混合液中获得的最高拷贝数，达到1011 copies/g 样本的数量级。通过qPCR检测到的AOA-amoA基因拷贝数为105-108 copies/g 样本（图S2a），远低于AOB-amoA基因的拷贝数。HAO基因的拷贝数（如图S2b所示）随着 O2/CH4比率在中空膜和液体中趋于减少，它们在混合填料中保持在109 copies/g 样本的数量级。化学自养硝化细菌，通常是Nitrosomonas ，通过将氨氧化为亚硝酸盐来获取生长能量。另外，一些异养细菌也具有硝化作用。AMO和HAO基因是参与化学自养和异养氨氧化的主要功能基因。基于16S rRNA测序确定的群落中的AOB揭示了两个属于Nitrosomonadales的属， Nitrosomonas和一个未分类的Nitrosomonadales属。AOB相对丰度的变化趋势与液体/混合填料中amoA基因拷贝的趋势基本一致（R2=0.43 ， P=1.354E-06 ，图6b），说明液体/混合填料主要富集化能自养型AOB 。中空膜微生物中化能自养型AOB的相对丰度降低，但amoA基因拷贝数呈阶段性增加趋势，这可能表明异养硝化细菌参与分布于中空膜附近。
nxrB基因范围为109-1010copies/g 样本，中空膜微生物中该基因拷贝数明显较高，液体和混合填料略微较少（图5g-i）。这意味着中空膜微生物可能倾向于富含能够氧化亚硝酸盐的细菌。我们之前的研究表明，铵可以被部分氧化，但当缺乏碳源时，亚硝酸盐会大量积累，这很好地支持了本研究中观察到的现象。AOB在液体/混合填料中高度富集， NOB倾向于粘附在中空膜处。由于NOB具有对有机物的偏好，进一步支持了异养硝化作用在中空膜附近的存在。
对反硝化过程中的限速酶基因nirS基因的检测发现，随着供氧量的增加，各部分nirS基因拷贝数均增加（图5j-l）。最高的提升发生在液体中，从105 copies/g 样本上升到 108 copies/g 样本。nirS基因拷贝数在混合填料中维持在108-109 copies/g 样本的数量级，中空膜微生物最高拷贝数为2.28×1010 copies/g 样本。nosZ基因拷贝数的趋势（图S2b）与中空膜和混合填料中nirS基因拷贝数的趋势一致。通过16S rRNA基因测序鉴定的主要反硝化菌是Rhodanobacter、Chitinophagaceae、Comamonadaceae、Mesorhizobium、Methylobacillus、Comamonas和Hyphomicrobium 。然而，反硝化菌的总相对丰度在液体中最高，在中空膜中最低，这与nirS基因拷贝不一致（R2=0.0605 ， P=0.0884 ，图6d）。尽管在此总结了主要的反硝化菌，但这些反硝化菌的总相对丰度并不能代表系统中所有反硝化菌的总体趋势。qPCR揭示的nirS基因拷贝表明反硝化菌的数量随着曝气提升而增加，并且反硝化菌更喜欢粘附在中空膜上。这两个现象引起了人们的兴趣。反硝化菌聚集在中空膜的原因可能是中空膜处甲烷氧化产生的碳源充足。另一个问题则是为什么它们在高氧下更为活跃。其原因有两个假设：1）兼性厌氧反硝化菌可以在高碳和高溶解氧条件下进行有氧呼吸；2）好氧反硝化菌在好氧条件下可以进行硝酸盐还原。在第一个假设中，如果兼性厌氧反硝化菌以氧为电子受体进行呼吸，反硝化效率将受到高度抑制， TN则应积累。回顾图1中的氮转化和去除， TN没有积累。因此，好氧反硝化菌更有可能成为系统中的主要反硝化菌。上面确定的主要反硝化菌包括传统的兼性厌氧反硝化菌，如Rhodanobacter、Chitinophagaceae和Hyphomicrobium ，同时也包括一些好氧反硝化菌，如Comamonadaceae、Comamonas和Mesorhizobium 。此外，一种属于拟杆菌门的未分类细菌在各部分相对丰度较高，在第三阶段的相对丰度最高。该细菌可能在系统中具有一定的功能，但无法通过16S rRNA测序进行鉴定。宏基因组学将是一项进一步研究该体系中各种功能微生物的功能和相互作用的良好工具。